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腺病毒ADV
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腺病毒（Adenovirus, ADV）是一種無包膜的線性雙鏈DNA病毒，具有廣泛的細(xì)胞和組織感染能力。感染過程劇烈，適于短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行基因高表達(dá)的實(shí)驗(yàn)，與其它病毒相比，腺病毒優(yōu)勢(shì)在于插入片段較長，表達(dá)活性強(qiáng)。
體外應(yīng)用時(shí)，腺病毒載體轉(zhuǎn)基因效率高（接近100%的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率），且可轉(zhuǎn)導(dǎo)不同類型的細(xì)胞，對(duì)于大量難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因遞送是一個(gè)很好的工具。但是，在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)，由于腺病毒免疫原性強(qiáng)，感染劇烈，故常會(huì)引起動(dòng)物局部組織炎癥反應(yīng)和機(jī)體免疫反應(yīng)，對(duì)動(dòng)物體征和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的客觀性造成影響。
ADV包裝和侵染過程
腺病毒包裝與純化
腺病毒包裝骨架達(dá)質(zhì)粒與穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)CPE狀態(tài)后通過收集細(xì)胞上清和細(xì)胞裂解物，通過濃縮或氯化銫密度梯度離心純化病毒。
CPE（Cytopathic Effect）：病毒對(duì)組織培養(yǎng)細(xì)胞侵染后產(chǎn)生的細(xì)胞變性，利用此種病變效應(yīng)可進(jìn)行病毒定量。
腺病毒滴度檢測(cè)
檢測(cè)方法：酶聯(lián)免疫法腺病毒滴度測(cè)定，根據(jù)計(jì)算感染后染成褐色的陽性細(xì)胞數(shù)，來計(jì)算病毒滴度。
實(shí)驗(yàn)原理：腺病毒感染的陽性細(xì)胞表達(dá)的衣殼蛋白被染成褐色。
檢測(cè)方法：免疫顯色方法
實(shí)驗(yàn)原理：通過抗5型腺病毒外殼蛋白的單抗與待感染腺病毒樣品的細(xì)胞結(jié)合，再用HRP標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，經(jīng)顯色液顯色，被感染的細(xì)胞變成褐色，根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)，來計(jì)算病毒滴度。
腺病毒載體優(yōu)勢(shì)
① 表達(dá)快，腺病毒感染細(xì)胞后，1-2天即可表達(dá)
② 載體容量大，感染效率高，常用于感染難感染的細(xì)胞
③ 不整合到染色體中，無插入致突變性
④ 具有嗜肝性，易于感染肝細(xì)胞，腺病毒的體內(nèi)應(yīng)用是用于感染肝臟
不過由于腺病毒免疫原性高，對(duì)某些對(duì)外源刺激敏感的動(dòng)物模型和組織中易造成炎癥，體內(nèi)應(yīng)用需謹(jǐn)慎。
不同病毒的生物學(xué)特性比較
載體選擇
煊晟興成生物擁有豐富的腺病毒產(chǎn)品，用于操作編碼基因和非編碼基因，如lncRNA、microRNA、circRNA。
以下腺病毒載體可供您選擇：
調(diào)控方式 | 載體名稱（載體元件順序） | 真核抗性 | 熒光 | 啟動(dòng)子 | 默認(rèn)標(biāo)簽 | 載體容量 |
過表達(dá) | pADV-mCMV-MCS-3xFLAG | N/A | N/A | mCMV | 3FLAG | >6kb |
pADV-mCMV-EGFP-3xFLAG | N/A | EGFP | mCMV | 3FLAG | >5kb | |
pADV-mCMV-3xFLAG-EGFP | N/A | EGFP | mCMV | 3FLAG | >5kb | |
pADV-mCMV-3xFLAG-P2A-EGFP | N/A | EGFP | mCMV | 3FLAG | >5kb | |
pADV-mCMV-mCherry-HA | N/A | mCherry | mCMV | HA | >5kb | |
pADV-mCMV-3xFLAG-T2A-mCherry | N/A | mCherry | mCMV | 3FLAG | >5kb | |
pADV-EF1-mNeonGreen-CMV-MCS-3xFLAG | N/A | mNeonGreen | CMV | 3FLAG | >4kb | |
pADV-EF1-mScarlet-CMV-MCS-3xFLAG | N/A | mScarlet | CMV | 3FLAG | >4kb | |
circRNA過表達(dá) | pADV-CMV-S-circRNA | N/A | N/A | CMV | N/A | >5kb |
miRNA過表達(dá) | pADV-U6-miR30(miRNA)-CMV-EGFP | N/A | EGFP | U6 | N/A | N/A |
表達(dá)cre | pADV-CMV-Cre | N/A | N/A | CMV | N/A | N/A |
干擾 | pADV-U6-shRNA-CMV-EGFP | N/A | EGFP | U6 | N/A | N/A |
pADV-U6-shRNA-CMV-mCherry | N/A | mCherry | U6 | N/A | N/A | |
CRISPR敲除 | pADV-U6-spgRNA v2.0-CMV-3xFLAG-spCas9 | N/A | N/A | U6 | 3FLAG | N/A |
pADV-U6-spgRNA v2.0-CMV-sfGFP-P2A-3xFLAG-spCas9 | N/A | sfGFP | U6 | 3FLAG | N/A | |
pADV-U6-spgRNA v2.0-CMV-EGFP | N/A | EGFP | U6 | N/A | N/A | |
pADV-CMV-mCherry-P2A-3xFLAG-spCas9 | N/A | mCherry | CMV | 3FLAG | N/A | |
pADV-CMV-mCherry-P2A-3xFLAG-eSpCas9_1.1 | N/A | mCherry | CMV | 3FLAG | N/A |
應(yīng)用實(shí)例
1.[腺病毒, 肝臟]
感染部位：肝臟
載體名稱：Ad-CBS
注射方式：尾靜脈
注射量：1 x1011 PFU/mL，10ul
檢測(cè)時(shí)間：7天
2. [腺病毒, 肝臟]
感染部位：肝臟
載體名稱：Ad-ATG7
注射方式：尾靜脈
注射量：1 x109 PFU /只
檢測(cè)時(shí)間：10天
3. [腺病毒, 大鼠]
注射部位：大鼠大腦皮層
載體名稱：Ad-FBLN
注射方式：腦立體定位注射
注射量：三種不同劑量
檢測(cè)時(shí)間：7天
腺病毒的生產(chǎn)和質(zhì)控采取了國際學(xué)術(shù)界公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)流程，采用AdEasy及Admax腺病毒包裝系統(tǒng)在HEK-293細(xì)胞中進(jìn)行包裝。所獲得的病毒顆粒經(jīng)過超速密度梯度離心和過濾，并通過殼蛋白免疫法進(jìn)行滴度測(cè)定。一般情況下腺病毒的滴度在1010~1011pfu/ml，完全可以滿足各類實(shí)驗(yàn)的使用要求。