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腺相關(guān)病毒AAV
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腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（parvoviridae）家族的成員之一，是一類無法自主復(fù)制、無被膜的二十面體微小病毒，其直徑約20-26nm，含有4.7kb左右的線狀單鏈DNA作為基因組。研究中采用的重組腺相關(guān)病毒載體（recombination adeno-associated virus, rAAV）是在非致病的野生型AAV基礎(chǔ)上改造而成的基因載體，由于其種類多樣、免疫原性極低、安全性高、宿主細(xì)胞范圍廣（對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力）、擴(kuò)散能力強、體內(nèi)表達(dá)基因時間長等，rAAV被視為最有前途的基因研究和基因治療載體之一。
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AAV基因組結(jié)構(gòu)
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rAAV包裝純化及滴度檢測
AAV包裝過程中，包裝質(zhì)粒負(fù)責(zé)編碼目的基因以及兩個末端反向重復(fù)序列（ITR，對于病毒的復(fù)制和包裝具有決定性作用），輔助質(zhì)粒包含AAV包裝所需的cap（編碼病毒衣殼蛋白）和rep（參與病毒的復(fù)制）基因，以及腺病毒Helper質(zhì)粒。三種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，AAV病毒開始復(fù)制和包裝。煊晟興成生物腺相關(guān)病毒的生產(chǎn)和質(zhì)控采取了國際學(xué)術(shù)界公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)流程，采用三質(zhì)粒系統(tǒng)在293T細(xì)胞中進(jìn)行包裝。所獲得的病毒顆粒經(jīng)過超速離心純化，并通過qPCR對病毒基因拷貝進(jìn)行滴定。另外，我們也可以根據(jù)使用者要求，提供蛋白染色檢測衣殼蛋白的完整性以及內(nèi)毒素含量等。一般情況下rAAV的滴度在1012~1013 VG/ml，完全可以滿足各類整體實驗的使用要求。
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AAV包裝流程圖
滴度檢測方法：定量PCR檢測病毒基因組中外源DNA拷貝數(shù)。
滴度檢測原理：腺相關(guān)病毒的基因組為單鏈DNA，外源DNA拷貝數(shù)代表病毒基因組拷貝數(shù)。病毒AAV767.png){kind=small}
rAAV侵染細(xì)胞過程
煊晟興成生物純化后的AAV病毒載體可以用于侵染細(xì)胞，侵染細(xì)胞時，AAV與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，激活胞內(nèi)信號通路，進(jìn)而觸發(fā)AAV通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，在核內(nèi)體、高爾基體等細(xì)胞器的協(xié)助下進(jìn)入細(xì)胞核，隨后病毒裂解，其單鏈DNA需復(fù)制成為雙鏈DNA后表達(dá)目的基因。
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rAAV作用機制
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rAAV載體優(yōu)勢
1、安全性高、免疫原性低：AAV是一種復(fù)制缺陷型DNA病毒，無自主復(fù)制能力，野生型AAV依賴rep基因進(jìn)行低頻定點整合，rAAV不整合。目前尚無由AAV引起的人類及哺乳動物疾病報道，也是FDA批準(zhǔn)上市的基因治療藥物中最安全的病毒載體之一。
2、宿主細(xì)胞范圍廣：AAV具有廣泛的宿主范圍，對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。
3、擴(kuò)散能力強：AAV直徑約20-26nm，體積小，滴度高，具有良好的擴(kuò)散能力，其中AAV-PHP.eB和AAV9具有跨血腦屏障的能力，在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。
4、體內(nèi)表達(dá)基因時間長：AAV具有保持長期基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)能力，體內(nèi)表達(dá)一般3周可以達(dá)到高峰，隨后持續(xù)高表達(dá)，作用時間＞5個月。
5、種類多樣：AAV血清型眾多，此外，根據(jù)不同的實驗設(shè)計，我們還在不斷的突變，篩選新的血清型（AAV1-13，AAV2/1, 2/2, 2/5, 2/6, 2/8, 2/9, DJ; retro, PHP.eB…）。
不同病毒的生物學(xué)特性比較
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基于上述特點，AAV被視為是一種高效和安全的體外及體內(nèi)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)工具。尤其在整體水平研究中，與其他常用病毒工具載體相比，AAV具有感染過程溫和長效的表達(dá)能力，是基因操作的利器。
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rAAV血清型選擇
目前已注冊的AAV種類總數(shù)已超過196種，靈長類動物體內(nèi)有13種不同血清型的AAV（即AAV1-AAV13），其中AAV2、AAV3、AAV9源自人類本身，值得注意的是，AAV2是最早被克隆的病毒，也是迄今研究最為徹底、應(yīng)用最為廣泛的病毒載體。隨著研究的不斷深入，研究人員發(fā)現(xiàn)不同血清型的AAV之間可以雜交，而雜交后的AAV會兼有雜合雙方的特點，因此，AAV亞型順勢誕生。
現(xiàn)在研究中常用的rAAV就是利用AAV2型基因組與不同的衣殼蛋白結(jié)合產(chǎn)生的混合體病毒載體，一般標(biāo)記為rAAV2/N (N為不同的衣殼血清型)。重組的病毒具有AAV2型的穩(wěn)定表達(dá)和基因整合能力，同時獲得了不同血清型的組織感染嗜親性（不同血清型衣殼表面的特定結(jié)構(gòu)位點決定了各自受體的特異性），表現(xiàn)出一定的器官靶向特異性。
不同血清型AAV的組織嗜親性
血清型 | 組織親和性 |
rAAV2/1 | 神經(jīng)系統(tǒng)（高滴度順向跨突觸），肌肉，骨骼肌，心肌，平滑肌 |
rAAV2/2 | 視網(wǎng)膜、神經(jīng)系統(tǒng)，肌肉，肝臟，血管平滑肌 |
rAAV2/3 | 肌肉，肝臟，肺，眼 |
rAAV2/4 | 神經(jīng)系統(tǒng)，肌肉，眼，腦 |
rAAV2/5 | 神經(jīng)系統(tǒng)，肺，視網(wǎng)膜，肝臟，滑膜關(guān)節(jié) |
rAAV2/6 | 神經(jīng)系統(tǒng)，肺，肌肉，心臟 |
rAAV2/7 | 肌肉，肝臟 |
rAAV2/8 | 神經(jīng)系統(tǒng)，肝臟，肌肉，脂肪組織，胰腺，視網(wǎng)膜， |
rAAV2/9 | 神經(jīng)系統(tǒng)，心肌，肺，視網(wǎng)膜，皮膚 |
rAAV2-retro | 神經(jīng)系統(tǒng)（逆向非跨突觸） |
AAV-PHP.eB | 跨血腦屏障（靜脈注射） |
AAV-PHP.S | 全外周神經(jīng)（尾靜脈注射） |
AAV-PAN | 胰腺（腹腔注射） |
AAV-LUNG | 肺（尾靜脈注射） |
AAV-DJ | 視網(wǎng)膜，肺，腎臟，體外感染細(xì)胞 |
AAV-7m8 | 視網(wǎng)膜 |
AAV-ShH10Y | 視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞 |
AAV-Rh10 | 肝臟，血液，心臟，體外感染細(xì)胞 |
AAV-Anc80L65 | 內(nèi)耳、視網(wǎng)膜、骨骼肌、肝臟 |
AAV-SCH9 | SVZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞 |
小建議：如您不確定選擇哪種血清型，可嘗試使用Pandora’s Virus （AAV多種血清型）進(jìn)行預(yù)實驗，通過比較不同血清型對目標(biāo)組織的感染效果，摸索最佳實驗條件（注射方法、注射位點、病毒用量等），以便得到更理想的實驗結(jié)果。
Pandora’s Virus 詳情：
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rAAV載體應(yīng)用案例
1、在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用
1.1 外側(cè)韁核&光遺傳學(xué)
[腺相關(guān)病毒, 抑郁癥, 光遺傳]
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注射部位：小鼠LHb
載體：AAV2/9-hSyn-oChIEF-tdTomato
血清型：AAV2/9
病毒滴度：6.29E+12 VG/mL
注射體積：100nl
觀察時間：1個月
1.2 臂旁核&化學(xué)遺傳學(xué)
[腺相關(guān)病毒, 癢, 光遺傳,化學(xué)遺傳]
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注射部位：小鼠PBN
載體：AAV-hSyn-HA-hM4Di-IRES-mCitrine
血清型：AAV2/9
病毒滴度：1E+13 VG/mL
注射體積：150nl
觀察時間：3周
1.3 丘腦&鈣離子成像
[腺相關(guān)病毒, 覺醒]
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注射部位：小鼠PVT
載體：AAV-CaMKIIα-GCaMP6f
注射體積：100nl
觀察時間：4周
1.4 丘腦室旁核&殺死神經(jīng)元
[腺相關(guān)病毒, 覺醒]
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注射部位：小鼠PVT
載體：AAV-CaMKIIα-Cre-GFP &AAV-DIO-caspase-3
注射體積：兩支病毒1:1混合注射100nl
觀察時間：4周
1.5 海馬、皮層&逆向非跨突觸（rAAV2/retro）
[腺相關(guān)病毒, 焦慮癥, 光遺傳]
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注射部位：小鼠dmPFC、VHPC
載體：AAV2/1-retro-Syn-eYFP-Cre、AAV2/8-CaMKIIα-DO-SK2&AAV2/8-CaMKIIα-DIO-SK2-mCherry
注射體積：300nl
觀察時間：4周
1.6 初級運動皮層&順向跨突觸（rAAV2/1）
[腺相關(guān)病毒, 神經(jīng)環(huán)路]
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注射部位：小鼠皮層M1、PMC
載體：rAAV2/1-hSyn-Cre&rAAV2/9-DIO-hChR2(H134R)-mCherry、rAAV2/9-DIO-GCaMP6s
病毒滴度：rAAV2/1: 5E+12 VG/mL；rAAV2/9-DIO-hChR2：1.2E+13 VG/mL；rAAV2/9-DIO-GCaMP6s：1E+12 VG/mL
注射體積：多點注射，每位點30-40nl
觀察時間：4周
1.7 邊緣前皮質(zhì)&跨突觸示蹤（WGA-Cre）
[腺相關(guān)病毒, 成癮, AAV1, AAV-WGA-Cre]
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注射部位：小鼠PrL
載體：AAV-hSyn-mCherry-IRES-WGA-Cre
病毒滴度：4.28E+12 VG/mL
注射體積：300nl
觀察時間：4周
1.8 皮層&AAV干擾（AAV-shRNA）
[腺相關(guān)病毒, 抑郁癥]
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注射部位：小鼠mPFC
載體：AAV-CMV-P2rx2 shRNA-EGFP
病毒滴度：3E+12 VG/mL
注射體積：1.5ul
觀察時間：2周
1.9稀疏標(biāo)記
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載體信息：pAAV-PTRE-tight-NLS-Cre（108-109VG/mL）、pAAV-EF1a-DIO(tTA-P2A-mScarlet)-WPRE（1012VG/mL）
rAAV2/8尾靜脈注射感染肝臟實例
病毒總量：1E+11VG
注射體積：200ul
病毒表達(dá)時間：四周
2..0 rAAV感染肺部
[腺相關(guān)病毒, 干擾]
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注射方式：氣管注射
感染部位：肺部
載體：pAAV-Tgfb1 shRNA
血清型：rAAV2/9
病毒注射量：1E+11 VG（50ul）
觀察時間：3周