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基因過表達
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基因功能研究中通常需要上調目的基因的表達來觀察表型的變化。過表達是將目的基因在宿主細胞大量表達的過程，其基本原理是將目的基因構建到工具載體上，導入細胞使基因實現大量轉錄和翻譯，從而實現基因產物的過表達。工具載體通常包括原核表達載體、普通真核表達載體、慢病毒載體、腺相關病毒載體、腺病毒載體和逆轉錄病毒載體等。
工具載體介紹
根據實驗需要不同，目的基因大小等選擇不同的載體，包括真核表達載體和病毒載體等均可以實現編碼基因和非編碼基因的過表達。
表達系統 | 真核表達載體 | 慢病毒載體 | 重組腺相關病毒載體 | 重組腺病毒載體 |
載體基因特性 | 雙鏈DNA質粒 | RNA逆轉錄病毒 | 單鏈DNA病毒 | 雙鏈DNA病毒 |
外源基因表達時間 | 24h開始表達，持續3-7天 | 2-4天開始表達，長時間穩定表達 | 7-14天開始表達 | 1-2天開始表達 |
插入片段大小 | 8kb左右 | 4kb左右 | 2.8kb左右 | 4kb左右 |
穩定細胞株篩選 | 難操作 | 可以 | 不可以 | 不可以，瞬時表達 |
細胞實驗 | 細胞系，部分轉染效率低 | 首選，廣譜，感染效率高 | 細胞系，部分血清型轉染效率低 | 廣譜，感染效率高 |
動物實驗 | 不適合 | 適合，根據觀察時間和注射部位 | 首選，根據觀察時間和注射部位 | 免疫原性高，慎選 |
滴度范圍 | 無 | 108~109TU/ml | 1012-1013VG/ml | 1010-1011PFU/ml |
載體圖譜中常見元件介紹
元件名稱 | 類型 | 用途 |
啟動子 | CMV、CAG、EF1a、U6等 | 廣譜或特異啟動目的基因的表達 |
hSyn、CaMKIIα等 | 特異性啟動子，在特定的組織細胞中啟動目的基因的表達 | |
蛋白標簽 | 3xFLAG、HA 、6xHis、Myc等 | 與目的基因融合表達，常用于檢測外源蛋白表達水平 |
熒光標記 | EGFP、mCherry、mNeonGreen等 | 可與目的基因融合或非融合表達用于檢測轉染、感染效果 |
抗性基因 | Puro、Neo、Hygro、BSD等 | 真核抗性，常用于穩定株篩選 |
Amp、Kan | 原核抗性，常用于原核細菌培養，質粒擴增 | |
連接元件 | Linker | 用于連接兩個基因，融合表達時常用，可降低因融合表達對蛋白折疊和功能的影響 |
IRES、2A | 用于連接兩個基因，達到非融合表達的效果 | |
其它元件 | WPRE | 增加目的基因的表達 |
載體選擇（部分）
病毒載體的選擇，根據實驗的需求參考慢病毒、腺相關病毒、腺病毒、逆轉錄病毒等。
載體類別 | 載體元件 |
慢病毒過表達 | pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAG-WPRE |
pSLenti-EF1-EGFP-CMV-MCS-WPRE | |
pSLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE | |
pSLenti-EF1-EGFP-F2A-BSR-CMV-MCS-WPRE | |
pSLenti-EF1-Luc2-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE | |
腺病毒過表達 | pADV-mCMV-MCS-3xFLAG |
pADV-mCMV-EGFP-3xFLAG | |
pADV-mCMV-3xFLAG-EGFP | |
pADV-mCMV-mCherry-HA | |
腺相關病毒過表達 | pAAV-CMV-EGFP-P2A-3xFLAG-WPRE |
pAAV-CMV-mCherry-P2A-3xFLAG-WPRE | |
pAAV-hSyn-EGFP-P2A-3xFLAG-WPRE | |
AAV-hSyn-mCherry-P2A-3xFLAG-WPRE | |
pAAV-CAG-EGFP-3xFLAG-tWPA | |
pAAV-CMV-EGFP-3xFLAG-tWPA | |
pAAV-CAG-EGFP-3xFLAG-tWPA | |
pAAV-CMV-EGFP-3xFLAG-tWPA |
服務簡介
根據客戶提供的基因信息，從生物信息學網站上調出該基因的cDNA序列，將cDNA序列構建到工具載體中，根據實驗需求過表達編碼基因或者非編碼基因。針對病毒載體，包裝生產的病毒顆粒可以直接用于感染細胞或者動物實驗。
病毒載體服務流程
物種及目的基因名稱 病毒表達載體構建 高滴度的病毒顆粒
病毒載體要求與選擇 (病毒包裝與純化） 按合同提供對照病毒）
其它特殊需求 滴度測定 實驗報告