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成像技術(shù)

業(yè)務(wù)咨詢18392631026

腦科學(xué)研究的關(guān)鍵是要實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)元集群活動(dòng)的實(shí)時(shí)觀察，并通過(guò)特定神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)追蹤及其活動(dòng)操縱，研究其對(duì)腦功能的充分性和必要性，進(jìn)而在全腦尺度上解析神經(jīng)環(huán)路的功能和結(jié)構(gòu)。

鈣離子成像技術(shù)

鈣離子成像技術(shù)（Calcium imaging）是指利用鈣離子指示劑監(jiān)測(cè)組織內(nèi)鈣離子濃度的方法，常用于神經(jīng)系統(tǒng)的研究，指示神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的變化，提示神經(jīng)元活動(dòng)。其原理在于借助鈣離子濃度與神經(jīng)元活動(dòng)之間的嚴(yán)格對(duì)應(yīng)關(guān)系，利用特殊的熒光染料或者蛋白質(zhì)熒光探針（鈣離子指示劑，Calcium indicator），將神經(jīng)元中鈣離子的濃度通過(guò)熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來(lái)，并被顯微鏡捕捉，從而達(dá)到監(jiān)測(cè)神經(jīng)元活動(dòng)的目的。

因而，鈣離子成像技術(shù)的核心在于鈣離子指示劑，現(xiàn)在廣泛使用的鈣離子指示劑有化學(xué)性鈣離子指示劑（chemical indicators）和基因編碼鈣離子指示劑（genetically-encoded indicators）兩類：

　　1、化學(xué)性鈣離子指示劑：指的是可以螯合鈣離子的小分子，所有這些小分子都基于BAPTA（氨基苯乙烷四乙酸），BAPTA能夠特異性地和鈣離子螯合，而不會(huì)和鎂離子螯合，所以被廣泛地用作鈣離子螯合劑。目前較為成熟的化學(xué)性鈣離子指示劑包括Oregon Green-1、Fura-2、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4。　

　　2、基因編碼鈣離子指示劑：這些指示劑是來(lái)自于綠色熒光蛋白（GFP）及其變異體（例如循環(huán)排列GFP、YFP、CFP）的熒光蛋白質(zhì)，與鈣調(diào)蛋白（CaM）和肌球蛋白輕鏈激酶M13域融合。現(xiàn)在使用較廣泛的基因編碼鈣離子指示劑有：GCaMP、Pericams、Cameleons、TN-XXL和Twitch，其中GCaMP6由于它有著超強(qiáng)的敏感度，現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用于活體鈣成像研究，其發(fā)出熒光的原理在于鈣離子濃度上升導(dǎo)致M13與CaM結(jié)合，從而改變cpEGFP的構(gòu)象，將其從無(wú)熒光的狀態(tài)變?yōu)榫G色熒光。

GCaMP蛋白的基本結(jié)構(gòu)和原理（Jasper Akerboom, et al., Biol Chem,2009）

常見的可遺傳編碼鈣離子指示劑

鈣離子成像技術(shù)是一類可以在活體動(dòng)物觀察神經(jīng)元活動(dòng)的技術(shù)，其突出優(yōu)點(diǎn)在于能夠同時(shí)觀察一群細(xì)胞的活動(dòng)，借助病毒載體的特異性表達(dá)能力和神經(jīng)環(huán)路標(biāo)記能力，我們還可以觀察特定類型細(xì)胞的活動(dòng)。

電壓成像技術(shù)

神經(jīng)元細(xì)胞膜上的電勢(shì)是大腦中重要的信息載體。因此，監(jiān)測(cè)單個(gè)神經(jīng)元的電壓動(dòng)態(tài)，從突觸輸入到軸突輸出，對(duì)于理解行為背后的神經(jīng)過(guò)程是至關(guān)重要的。

細(xì)胞的細(xì)胞膜上鑲嵌的各種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和跨膜離子通道可以控制Na+、K+等離子進(jìn)出細(xì)胞。從而形成持續(xù)存在的跨膜離子濃度梯度，由此形成的胞內(nèi)外的電位差異就是膜電位。當(dāng)細(xì)胞接受外界刺激時(shí)，膜電位會(huì)發(fā)生變化，而電壓成像技術(shù)的基本原理就在于通過(guò)對(duì)電壓敏感的熒光指示劑 (Voltage Indicators) 直接標(biāo)記膜電位變化，再借助熒光成像手段監(jiān)測(cè)神經(jīng)元電活動(dòng)。

1、最初科學(xué)家們會(huì)借助傳統(tǒng)電壓敏感染料進(jìn)行神經(jīng)活動(dòng)的動(dòng)態(tài)研究，然而電壓敏感染料的光信號(hào)太弱，由膜電位變化引起的染料信號(hào)變化只有靜息時(shí)背景光強(qiáng)的萬(wàn)分之一到百分之一，同時(shí)，化學(xué)染料對(duì)細(xì)胞選擇性差，無(wú)法做到特異性對(duì)不同類型的細(xì)胞進(jìn)行觀察。此外，電壓敏感染料會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生永久性的變化，甚至改變其光動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，無(wú)法對(duì)活體動(dòng)物進(jìn)行長(zhǎng)期觀察。

2、基因編碼的電壓指示劑（genetically encoded voltage indicators, GEVIs）：和電壓敏感染料相比，GEVIs 最大的優(yōu)勢(shì)就是可以特異性地標(biāo)記各種類型的神經(jīng)元或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)高時(shí)空分辨率的成像工作。GEVIs 一般基于以下三種工作機(jī)制：

①膜電位發(fā)生變化時(shí)，細(xì)胞膜上鑲嵌的許多蛋白質(zhì)分子都會(huì)改變形狀，這類隨膜電位改變形狀的蛋白分子叫電壓敏感元件。將電壓敏感元件與熒光蛋白或化學(xué)共價(jià)熒光標(biāo)記蛋白相結(jié)合，形成一個(gè)嵌和蛋白，當(dāng)細(xì)胞膜電壓發(fā)生改變時(shí)，電壓蛋白構(gòu)象發(fā)生變化會(huì)干擾熒光蛋白發(fā)色團(tuán)的化學(xué)環(huán)境，從而改變熒光亮度。

②基于視紫紅質(zhì)等視蛋白（Opsin）的電壓敏感熒光探針，微生物視紫紅質(zhì)的吸收和熒光都是電壓敏感的，且反應(yīng)迅速，膜電位發(fā)生變化時(shí)，視蛋白通道構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而影響視蛋白的熒光發(fā)生變化。

③能夠感知電壓變化的FRET（熒光能量共振轉(zhuǎn)移, fluorescence resonance energy transfer, FRET）探針，將熒光蛋白融合到電壓敏感元件或視蛋白上，當(dāng)細(xì)胞膜電位發(fā)生變化時(shí)，帶電荷的有機(jī)分子會(huì)在細(xì)胞膜中移動(dòng)，從而導(dǎo)致相連的熒光蛋白產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，改變其熒光亮度。

三種類型GEVIs的示意圖

（Storace, D., et al., Trends Neurosci, 2016）

電壓成像病毒列表

神經(jīng)元功能成像是探究神經(jīng)元編碼各種功能的重要科學(xué)手段，目前最常用方法為鈣成像和電壓成像。然而，神經(jīng)元鈣信號(hào)衰減很慢，不能充分表征動(dòng)作電位與閾下電位。基因編碼的電壓指示劑（GEVIs）能夠以高空間和時(shí)間分辨率監(jiān)測(cè)神經(jīng)元的快速放電信號(hào)與閾下電活動(dòng)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞膜電位的波動(dòng)，相比于鈣指標(biāo)，更能直接反映神經(jīng)元的活性。

神經(jīng)遞質(zhì)探針

人腦大約有1010-1012個(gè)神經(jīng)元，每個(gè)神經(jīng)元擁有103-104個(gè)突觸與其他神經(jīng)元形成聯(lián)系。神經(jīng)遞質(zhì)作為突觸間傳遞信息的重要“信使”，參與多種生理過(guò)程。神經(jīng)遞質(zhì)的正常釋放對(duì)于維持機(jī)體正常的生理功能發(fā)揮著重要作用,同時(shí),神經(jīng)遞質(zhì)的釋放與調(diào)節(jié)出現(xiàn)異常時(shí)，也常常伴隨著神經(jīng)退行性疾病、抑郁癥等疾病的發(fā)生發(fā)展。因此,在分子、細(xì)胞、環(huán)路等層面精確地分析檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)是如何參與并調(diào)節(jié)上述生理和病理過(guò)程,能夠更深入地了解疾病的發(fā)病機(jī)制,并為臨床藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

要更好地研究這些神經(jīng)遞質(zhì)在生理、病理過(guò)程中扮演的角色，研究人員需要實(shí)時(shí)檢測(cè)活體內(nèi)特定腦區(qū)的神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)變化，看清它們的“一舉一動(dòng)”。可遺傳編碼的神經(jīng)遞質(zhì)探針的成功開發(fā)可以實(shí)時(shí)精確的檢測(cè)內(nèi)源神經(jīng)遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，為研究大腦的復(fù)雜功能以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病機(jī)制的解析提供重要的工具。

由于該類探針具有可基因編碼的特性，研究者可以通過(guò)轉(zhuǎn)染、病毒注射以及構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等手段，將新型探針表達(dá)在細(xì)胞、小鼠腦片，以及活體果蠅、斑馬魚及小鼠中，并結(jié)合現(xiàn)有的成像技術(shù)，把“難以捉摸”的神經(jīng)遞質(zhì)變化情況變成了直觀、易測(cè)的熒光信號(hào)，做到在不影響細(xì)胞正常生理功能的情況下實(shí)時(shí)精確的檢測(cè)活體動(dòng)物中內(nèi)源神經(jīng)遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化。在此基礎(chǔ)上，科學(xué)家們還對(duì)探針進(jìn)行了全方位的優(yōu)化，，使具有極高的分子特異性和時(shí)空分辨率（時(shí)間上達(dá)到毫秒級(jí)，空間上即可測(cè)得特定腦區(qū)的整體觀，也可精確至單細(xì)胞）。

常見的可遺傳編碼的神經(jīng)遞質(zhì)探針

①GRAB神經(jīng)遞質(zhì)熒光探針：北京大學(xué)李毓龍教授團(tuán)隊(duì)利用可與神經(jīng)遞質(zhì)相結(jié)合的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）作為探針的骨架，成功開發(fā)出一系列新型可遺傳編碼的神經(jīng)遞質(zhì)熒光探針。其原理在于：在 GPCR 中存在一段配體（神經(jīng)遞質(zhì)）結(jié)合后構(gòu)象改變最顯著的區(qū)域，將循環(huán)重排并對(duì)構(gòu)象變化敏感的綠色熒光蛋白（cpEGFP）插入到該區(qū)域中，神經(jīng)遞質(zhì)與GPCR的結(jié)合會(huì)引起其構(gòu)象的改變,而這種變化又引起cpEGFP發(fā)生構(gòu)象的變化，進(jìn)一步影響其發(fā)色團(tuán)周圍的微環(huán)境,最終導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度的改變。

GRAB神經(jīng)遞質(zhì)熒光探針示意圖

（Li Research Lab http://www.yulonglilab.org/resources_cn.html）

②基于單熒光蛋白的可遺傳編碼的熒光探針：融合了來(lái)自細(xì)菌中可與神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合的蛋白以及經(jīng)過(guò)循環(huán)重排并對(duì)構(gòu)象變化敏感的綠色熒光蛋白(cpEGFP)，當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)與探針結(jié)合后，由于構(gòu)象改變而引發(fā)cpEGFP 熒光強(qiáng)度的變化，檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。